引言：我們在進行注射劑一致性評價研究中，往往會發(fā)現(xiàn)參比制劑采用了濕熱滅菌工藝，但該濕熱工藝條件有顯然又達(dá)不到F0>8。特別是一些來源于日本的注射劑，甚至于大輸液的產(chǎn)品，都采用的是F0<8的滅菌工藝，這是怎么回事呢？查閱日本厚生省發(fā)布的《通過最終滅菌方法生產(chǎn)無菌藥物的準(zhǔn)則》（下文簡稱日本的無菌指南），探究一下日本對于滅菌工藝選擇的要求。

雖然沒有像歐盟一樣畫出滅菌選擇決策樹，但是日本在對滅菌工藝選擇上的邏輯仍是基本一致的。那就是首選121℃，15min的濕熱滅菌條件，次選F0>8的滅菌條件，如果產(chǎn)品不能耐熱，再選擇其他F0<8的其他熱處理工藝。與歐盟無菌指南不同的是，日本對于F0<8的濕熱工序選擇有更加詳盡的描述。

在日本無菌指南的附錄——滅菌條件設(shè)計法中，提出可以選擇A/B/C/D四種方法中的任何一種，保證產(chǎn)品的無菌。

A、半周期法；B、過度殺滅法；C、生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法；D、絕對微生物負(fù)載法。

A：半周期法

不知道為什么叫這個名字，從做法來看似乎應(yīng)該叫雙周期法更合適。這種方法是在滅菌柜冷點的位置放置了初始細(xì)菌計數(shù)為10⁶?CFU的生物指示劑，其滅菌時間是所有生物指示劑死亡時間的兩倍。在過度殺滅法中，滅菌時間為12min，而在半周期法中，滅菌時間為14min至16min。初始細(xì)菌計數(shù)為10⁶?CFU的生物指示劑的存活概率在7 min時為10％，在8 min時為1％，因此（7 min至8min）× 2=14min至16min。與過度殺滅法相比，半周期法的時間會更長。歐盟藥典推薦的滅菌條件為121℃，15min，其實按日本的話說就是半周期法。歐盟無菌指南提到采用121℃，15min的滅菌條件的產(chǎn)品申報時可以不提交滅菌驗證資料，理由應(yīng)該就是半周期法對無菌保證有著極高的保險系數(shù)。

B：過度殺滅法

就是大家耳熟能詳?shù)腇0>12的滅菌條件，不再贅述。

C：生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法

簡而言之，這種方法適合于不能終端滅菌，但還是能夠耐受相對較高的F0值的產(chǎn)品。每批產(chǎn)品生產(chǎn)時，對滅菌前產(chǎn)品的耐熱菌種進行鑒定，并在滅菌操作時加入預(yù)設(shè)的生物指示劑。生物指示劑的D值應(yīng)高于每批產(chǎn)品經(jīng)鑒定的耐熱菌的D值。

這種方法基于生物指示劑的D值高于從菌種鑒定試驗中獲得的耐熱細(xì)菌的D值的前提，并且滅菌時間通常根據(jù)以下公式設(shè)置：

滅菌時間 = D × log No / N

?? D：生物指示劑的D121值

?? No：微生物允許殘存的概率（10^-6）

?? N：細(xì)菌初始數(shù)量

這里的細(xì)菌初始數(shù)量是最大微生物負(fù)載加上標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍，即打出1 或2 個lg值的富余量。過度殺滅法的F0值能達(dá)到12以上，而生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法通常具有F0值在6至7。

例如，假設(shè)對某產(chǎn)品污染菌的情況進行了調(diào)查，細(xì)菌的初始數(shù)量（估計值）為10²cfu，通過篩選獲得的最強耐熱菌的D值為0.2分鐘。那么，可以在實際滅菌工作中選擇更高D值的生物指示劑（D121=0.5），要達(dá)到10^-6的殺滅目標(biāo)則需要減少4 個lg值，則微生物F0值為F0?BIO?= 4×D121?= 4×0.5 = 2.0。即該產(chǎn)品采用F0值=2的滅菌工藝即可達(dá)到實際微生物殘存概率法<10^-6的效果。

此外，生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法，有必要進行每日微生物監(jiān)控，并不斷確認(rèn)微生物負(fù)載的量和耐熱菌的耐熱性。

D：絕對微生物負(fù)載法

比起上述生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法，絕對微生物負(fù)載法適合于對熱更加不穩(wěn)定的品種。思路與前者類似，但不再使用D值更高的生物指示劑，而是直接使用產(chǎn)品中的最強耐熱菌的D值來確定滅菌工藝的目標(biāo)F0值

假設(shè)下圖是某產(chǎn)品D值與溫度之間的關(guān)系。

圖 某產(chǎn)品D值與溫度之間的關(guān)系圖

從上圖可以看出，耐熱細(xì)菌的D121值為D121?= 10^{-0.1×121+11.5}= 0.25（分鐘），耐熱細(xì)菌為從10⁶減小到10^-6所需的F0值可以通過以下公式計算：

F0 = D121?×（lgA－lgB）

將A =10⁶，B =10^-6，D121?= 0.25代入該式，得出F0 = 0.25×（6 + 6）= 3.0。

此處獲得的F0 =3.0是設(shè)定滅菌條件的目標(biāo)值，可依此選擇滅菌條件并進行相應(yīng)滅菌驗證。實際上，在受控的生產(chǎn)設(shè)施中觀察到的微生物負(fù)載實際上遠(yuǎn)少于10⁶cfu，例如，如果最大微生物負(fù)載被證明為10²cfu，則微生物殺滅數(shù)從10²減少到10^-6個。要求的最小F0值為0.25×（2 + 6）= 2.0，要求F0≥2.0即可確保無菌。

當(dāng)然，在實際操作中，尚需考慮增加設(shè)定檢測回收率等的安全系數(shù)，目標(biāo)F0值不宜太低。

絕對微生物負(fù)載法，更加有必要進行連續(xù)并且頻繁的微生物調(diào)查，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了更強的耐熱菌，則需要評估對產(chǎn)品的影響。?

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總結(jié)：

綜上，日本無菌指南最大的特點是對F0值<8的熱處理工藝的選擇進行了詳細(xì)的講解。這可能是日本的注射劑產(chǎn)品很多都采用這種終端熱處理的原因所在。其實歐盟2019版的無菌指南對熱處理的很多要求和日本是一致的。如其指出：“在滅菌工藝驗證中的 SAL取決于用于工藝驗證的生物指示劑的耐熱性。當(dāng)在滅菌工藝的驗證中使用低D值的生物指示劑時，SAL在數(shù)值上更高，但是不提供與使用更耐熱的生物指示劑一樣高的安全閾值。SAL 應(yīng)該始終與 D 值相關(guān)，D 值高于常規(guī)生產(chǎn)中的正常生物負(fù)載?！?/em>這里闡述的理念正如日本的生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法所表達(dá)的一樣。滅菌條件可以降低，但必須基于科學(xué)的態(tài)度選擇無菌保證水平最高的方式，并進行嚴(yán)格的驗證和生產(chǎn)監(jiān)控。?